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利用農桿菌瞬時表達CRISPR編輯基因和快速篩選突變植株的新方法
來源:科學網   發布者:張小圈   日期:2018-06-11   今日/總瀏覽:4/8003

最近,美國康涅狄格大學和南京農業大學李義教授團隊在Horticulture Research發表了題為“A method for the production and expedient screening of CRISPR/Cas9-mediated non-transgenic mutant plants”的研究論文,首次系統報道利用農桿菌在植物細胞中瞬時表達Cas9和sgRNA序列而產生非轉基因突變體并高效快速篩選的新方法。

該技術為童期長的多年生植物和有性生殖后會產生性狀分離的雜合一年生植物提供了一個快速獲得不含有外源基因的基因編輯突變體的新方法。

1背景知識

以CRISPR /Cas9為代表的基因編輯技術正在被廣泛地應用于植物基因功能鑒定和品種改良等領域。為了獲得基因編輯植株,即突變體,一般情況下是將Cas9和sgRNA等外源序列整合到植物基因組后,通過它們的穩定表達實現目標基因的編輯,獲得突變體。對于遺傳背景純合的一年生植物,常用的方法是通過有性自交或雜交,使導入的外源基因和突變位點分離,從而獲得不含有外源基因的突變植株。但是對于童期為幾年甚至十幾年的多年生植物(特別是木本植物)和通過無性繁殖的雜合一年生植物,獲得非轉基因突變體要么周期長要么技術難度大。

農桿菌介導法是目前最成熟、最簡單的植物遺傳轉化方法,已經被廣泛應用于一年生和多年生植物遺傳轉化。當農桿菌侵染植物細胞,單鏈的T-DNA進入植物細胞后,合成為雙鏈。游離在細胞核中的雙鏈T-DNA上的基因即使未整合到植物基因組上也可以表達,這種表達被稱為瞬時表達。

2方法與結果

以煙草作為模式植物,李義教授團隊的實驗表明,T-DNA上的GUS報告基因在共培養的第3天和第4天時達到瞬時表達的峰值(圖A)。然后,他們用載體T-DNA上帶有Cas9和突變PDS(phytoene desaturase)基因的sgRNA的農桿菌侵染植物,共培養3天之后轉入含殺菌抗生素的芽再生培養基。培養和再生的全過程不加篩選轉基因細胞(植株)的抗生素或除草劑。幾周后獲得大量的再生苗,其中少量為pds的突變植株(圖B)。他們獲得pds突變體(白化苗)的平均效率為48%(突變芽/外植體),但是若以全部再生的植株為基數,白化pds突變體的頻率為2.6%。

該方法在農桿菌侵染后不加篩選壓的條件下進行植物再生,因此再生過程中會產生大量野生型植株。與pds突變體不一樣,大多突變體在幼苗期沒有可識別的表型,因此如何從眾多的再生植株中鑒定出突變體是獲得非轉基因突變植株的關鍵之一。

李義教授團隊應用高通量測序結合高分辨率熔解曲線分析(High Resolution Melting,HRM)的方法實現對突變植株的高效快速鑒定。他們將再生植株分為每42或84株一組的群體(待測群體),特異性擴增待測群體PDS基因上涵蓋sgRNA序列的DNA片段,作為深度測序的母樣品。同時用以野生型植物為模板擴增的DNA產物對母樣品作7倍稀釋,得到稀釋后的子樣品。然后將100%野生型、母樣品和子樣品同時進行高通量測序分析。圖C可見,在含有41株野生型和一株pds-12突變體的母樣品里,在AGATGAT等7個位點上,母樣品的測序變異頻率(紅三角)相比100%的野生型(黑色圓點)顯著提高。這說明這些位點可能有突變。但是,這些位點測序變異頻率的增加也可能是由測序本身的誤差造成的。此時,使用野生型DNA 7倍稀釋得到的子樣品的測序結果可用于鑒別突變的真實性。如果稀釋后的子樣品的這7個位點的測序變異頻率(藍色方塊)與母樣品一致,說明高變異率由測序誤差造成。如果變異頻率顯著下降,則說明這7個位點確實存在突變。

該團隊的稀釋檢測的新方法簡單可靠地解決了測序本身帶來的假陽性的問題。他們報道一共檢測8個1/42的群體(每個群體有42個植株,其中5個群體,每個群體包含1株突變體,另3個群體不含有突變體),測序鑒定結果與實際情況完全相符,其篩選突變體的準確率為100%。

為了進一步鑒定含有42個植株的群體中的單個突變體,李義教授團隊釆用了高分辨率熔解曲線分析方法。將高通量測序鑒定得到的每一個由42個植株組成的含有突變體的待測群體,進一步分為每7個植株一組,利用熒光定量PCR特異性擴增待測組和野生型植株sgRNA區域的序列,獲得的雙鏈DNA進行HRM分析。

混有突變體的雙鏈DNA經過高溫解鏈、低溫復性過程后會產生野生型與突變體的雜合雙鏈DNA。在接下來的升溫過程中,含有雜合雙鏈的DNA會形成與僅含野生型雙鏈DNA不同的熔解曲線,從而將群體之間的差異直觀地顯示出來,該方法的靈敏度可以達到1/20(見圖D),即20個植株中有一個突變植株可被檢出。他們選擇了7株植株為一組進行HRM分析,即將42株隨機平均分為6份,在鑒定出哪一組含有突變植株后,再將該組的7株植物分別提DNA,擴增含有sgRNA區域的片段,然后分別加入等量的野生型DNA擴增片段后進行HRM分析,鑒定出突變體。

最后一步則是利用特異PCR檢測和其它方法從所有突變植株中鑒別出哪些為非轉基因植株。用上述方法,該團隊在隨機選擇的29株白化苗中,鑒定出5株(17.2%)的白化突變體不攜帶T-DNA,證實為非轉基因突變體。

李義團隊所報道的CRISPR瞬時表達體系和快速高效的篩選方法將在無性繁殖的多年生植物上有廣泛的應用前景。其流程見圖E(以1000株再生苗為例)。

A: 煙草外植體分兩部分,一部分在共培養2,3,4,5,6 天后立即用GUS染液進行染色,此時信號包括瞬時表達信號和穩定表達信號;另一部分在共培養2,3,4,5,6 天后立即在含有殺菌劑的培養基上培養5天,然后用GUS染液進行染色,此時信號分別為共培養2,3,4,5,6 天時穩定表達的信號;結果發現,共培養的第3和第4天時達到瞬時表達的峰値。

B: 未添加篩選壓的再生培養基上獲得的白化突變體,同時再生出大量綠色野生型芽。

C: 高通量測序檢測pds-12突變體中CRISPR/Cas9剪切產生的突變。橫坐標為Cas9剪切位點附近序列及其核苷酸位置,紅色TGG序列為Cas9剪切所需的PAM序列,縱坐標為位點突變頻率。紅色三角、黑色圓圈和藍色方形分別代表含有41株野生型和一株pds-12突變體的母樣品、100%野生型樣品以及使用野生型樣品對母樣品進行7倍稀釋得到的子樣品中的突變頻率。圖中結果顯示,在已確認的pds-12突變體突變位點AGATGAT(位置45-51),母樣品的突變頻率顯著高于子樣品和野生型樣品;而在其他非突變位點,三類樣品中的突變頻率無明顯差異。

D: 高分辨率熔解曲線(HRM)分析檢測含有pds-12突變體的混樣群體。其中紅色曲線代表野生型群體(100% WT),藍色曲線代表突變體和野生型1:1比例的混樣群體(1mt:1wt),粉色曲線、綠色曲線和褐色曲線分別代表突變體和野生型1:6(1mt:6wt),1:19(1mt:19wt),1:29(1mt:29wt)的混樣群體。結果顯示藍色曲線、粉色曲線和綠色曲線均能和紅色曲線(野生型群體)明顯的分開,該結果表明HRM分析的靈敏度能夠達到1/20。

E: Cas9和sgRNA瞬時表達體系和快速高效的篩選方法流程圖。

3該方法的優缺點

1)農桿菌介導的瞬時表達體系操作簡單,植物種類的適用范圍極為廣泛,特別是近年來改良后的農桿菌能夠侵染的植物已經從雙子葉擴展到許多重要的單子葉植物。

2)由于在植株再生過程中不施加篩選壓,此方法將大幅提高不定芽的再生效率。遺傳轉化再生過程中化學篩選劑的施加,會使很多植物的再生變得異常困難,從而難以獲得轉基因植物。該方法的整個再生過程中不存在篩選壓,因此在許多植物中可能會大幅提高獲得基因編輯突變體的可能性。但是,無化學篩選壓導致的大量非突變植株的產生,也使突變體篩選工作量增大。

3)利用精心設計的高通量測序與HRM技術結合的兩步篩選法,能夠在兩星期左右快速準確地從幾千株再生芽中鑒定出突變株系。雖然,兩步篩選體系可以極大地提高從大量再生植株中篩選突變體的效率,但整個實驗流程還相對復雜。更為簡單和高效的篩選方法尚有待研發。

4作者

該方法第一作者陳龍正為江蘇農科院蔬菜所研究員,共同第一作者李威和丁靜分別為中國農業大學園藝學院引進人才、副教授和南京農業大學園藝學院副教授。通訊作者李義為美國康涅狄格大學教授,南京農大園藝學院兼職教授(2個月/年)。

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